Авторы:

Maximilian Ackermann, M.D., Stijn E. Verleden, Ph.D.,  Mark Kuehnel, Ph.D., et al.

Май 21, 2020
DOI: 10.1056/NEJMoa2015432

ФОН

Прогрессирующая дыхательная недостаточность является основной причиной смерти при пандемии коронавируса 2019 года (Covid-19). Несмотря на широко распространенный интерес к патофизиологии заболевания, относительно мало известно о связанных морфологических и молекулярных изменениях в периферическом легком пациентов, которые умирают от Covid-19.

МЕТОДЫ

Мы исследовали 7 легких, полученных во время вскрытия от пациентов, которые умерли от Covid-19, и сравнили их с 7 легкими, полученными во время вскрытия от пациентов, которые умерли от острого респираторного дистресс-синдрома (ARDS), вторичного по отношению к инфекции гриппа A (H1N1), и 10 по возрасту, неинфицированный контроль легких. Легкие были изучены с использованием семицветного иммуногистохимического анализа, микрокомпьютерной томографии, сканирующей электронной микроскопии, коррозионного литья и прямого мультиплексного измерения экспрессии генов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

У пациентов, которые умерли от дыхательной недостаточности, связанной с Covid-19 или гриппом, гистологическим паттерном в периферическом легком было диффузное альвеолярное повреждение с периваскулярной инфильтрацией Т-клеток. Легкие от пациентов с Covid-19 также показали отличительные сосудистые особенности, состоящие из серьезного эндотелиального повреждения, связанного с присутствием внутриклеточного вируса и разрушенных клеточных мембран. Гистологический анализ легочных сосудов у пациентов с Covid-19 показал широко распространенный тромбоз с микроангиопатией. Альвеолярные капиллярные микротромбы были в 9 раз чаще у пациентов с Covid-19, чем у пациентов с гриппом (P <0,001). В легких от пациентов с Covid-19 количество роста новых сосудов - преимущественно через механизм инвагинального ангиогенеза - было 2.

ВЫВОДЫ

В нашей небольшой серии ангиогенез сосудов отличал патологию легких Covid-19 от патологии вируса гриппа одинаково тяжелой степени. Универсальность и клинические последствия наших наблюдений требуют дальнейших исследований, чтобы определить. (Финансируется Национальными институтами здравоохранения и др.)

Инфекция с тяжелым острым респираторным синдромом коронавирус 2 (SARS-CoV-2) у людей связана с широким спектром клинических респираторных синдромов, начиная от легких симптомов со стороны верхних дыхательных путей и заканчивая прогрессирующей опасной для жизни вирусной пневмонией. ^1,2 Клинически, пациенты с тяжелой коронавирусной болезнью 2019 года (Covid-19) имеют затрудненное дыхание и прогрессирующую гипоксемию и часто получают искусственную вентиляционную поддержку. Рентгенологически, помутнение периферических легких в матовом стекле при компьютерной томографии (КТ) грудной клетки соответствует берлинским критериям острого респираторного дистресс-синдрома (ARDS). ^3,4 Гистологически отличительным признаком ранней фазы ОРДС является диффузное альвеолярное повреждение с отеком, кровоизлиянием и внутриальвеолярным отложением фибрина, как описано Katzenstein et al. ⁵Диффузное альвеолярное повреждение - это неспецифическая находка, поскольку оно может иметь неинфекционные или инфекционные причины, включая коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV), ⁶ SARS-CoV, ⁷ SARS-CoV-2, ^8-10 и вирусы гриппа. ¹¹

К отличительным признакам Covid-19 относятся сосудистые изменения, связанные с заболеванием. Что касается диффузного альвеолярного повреждения при инфекции SARS-CoV ⁷ и SARS-CoV-2, ^8,12 образование фибриновых тромбов наблюдалось анекдотически, но систематически не изучалось. Клинически, многие пациенты имеют повышенные уровни d- димера, а также кожные изменения в конечностях, что указывает на тромботическую микроангиопатию. ¹³ Диффузная внутрисосудистая коагуляция и тромбоз крупных сосудов были связаны с мультисистемной недостаточностью органов. ^14-16Периферические легочные сосудистые изменения менее хорошо характеризуются; однако васкулопатия в газообменных сетях, в зависимости от ее влияния на согласование возникающей вентиляции и перфузии, может потенциально способствовать гипоксемии и влиянию осанки (например, положения лежа) на оксигенацию. ¹⁷

Несмотря на предыдущий опыт с SARS-CoV ¹⁸ и ранний опыт с SARS-CoV-2, морфологические и молекулярные изменения, связанные с этими инфекциями в периферическом легком, недостаточно хорошо документированы. Здесь мы исследуем морфологические и молекулярные особенности легких, полученных во время вскрытия от пациентов, которые умерли от Covid-19, по сравнению с таковыми из легких от пациентов, которые умерли от гриппа и сопоставимых по возрасту неинфицированных контрольных легких.

ОТБОР ПАЦИЕНТОВ И РАБОЧИЙ ПРОЦЕСС

Мы проанализировали образцы легочного вскрытия от семи пациентов, которые умерли от дыхательной недостаточности, вызванной инфекцией SARS-CoV-2, и сравнили их с легкими от семи пациентов, которые умерли от пневмонии, вызванной вирусом гриппа A подтипа H1N1 (A [H1N1]) - штаммом, связанным с пандемиями гриппа 1918 и 2009 годов. Легкие пациентов с гриппом были заархивированы тканью после пандемии 2009 года и были выбраны для наилучшего возможного совпадения по возрасту, полу и тяжести заболевания из числа вскрытий, проведенных в Ганноверской медицинской школе. Десять легких, которые были пожертвованы, но не использовались для трансплантации, служили неинфицированными контрольными образцами. Группа Covid-19 состояла из легких двух женщин и пяти мужчин со средним (± SD) возрастом 68 ± 9,2 года и 80 ± 11,5 года соответственно (клинические данные приведены в таблице S1A в Дополнительном приложении , доступно с полным текстом этой статьи на NEJM.org). Группу гриппа составили легкие двух женщин и пять мужчин со средним возрастом 62,5 ± 4,9 года и 55,4 ± 10,9 года соответственно. Пять из неинфицированных легких были от женщин-доноров (средний возраст 68,2 ± 6,9 года), и пять были от мужчин-доноров (средний возраст 79,2 ± 3,3 года) (клинические данные представлены в таблице S1B). Исследование было одобрено и проведено в соответствии с требованиями комитетов по этике Ганноверской медицинской школы и Университета Лёвена. Не было никакой коммерческой поддержки для этого исследования.

Все легкие были всесторонне проанализированы с использованием микроСТ, гистопатологического и мультиплексного иммуногистохимического анализа, просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии, коррозионного литья и прямого мультиплексного анализа экспрессии генов, как подробно описано в разделе «Методы» в дополнительном приложении.

СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Все сравнения числовых переменных (в том числе в анализе экспрессии генов) проводились с помощью t-критерия Стьюдента по семейству по критерию множественности, установленному на уровне 0,05, с использованием метода Бенджамини-Хохберга для контроля ложных показателей обнаружения. Исходные значения P сообщаются только для тестов, которые соответствовали критериям для ложных показателей обнаружения. Все доверительные интервалы были также рассчитаны на основе t-распределения. Дополнительные сведения приведены в разделе «Методы» дополнительного приложения.

ПОЛНАЯ ЭКСПЕРТИЗА

Средний (± SE) вес легких у пациентов с доказанной гриппозной пневмонией был значительно выше, чем у пациентов с доказанным Covid-19 (2404 ± 560 г против 1681 ± 49 г; P = 0,04). Средний вес неинфицированных контрольных легких (1045 ± 91 г) был значительно ниже, чем в группе гриппа (P = 0,003) и группе Covid-19 (P <0,001).

АНГИОЦЕНТРИЧЕСКОЕ ВОСПАЛЕНИЕ

Фигура 1.Лимфоцитарное воспаление в легких у пациента, умершего от Covid-19.

Все образцы легкого из группы Covid-19 имели диффузное альвеолярное повреждение с некрозом клеток альвеолярной оболочки, гиперплазией пневмоцитов 2 типа и линейным внутриальвеолярным отложением фибрина ( рис. 1 ). В четырех из семи случаев изменения были очаговыми, только с легким интерстициальным отеком. Оставшиеся три случая имели гомогенные отложения фибрина и выраженный интерстициальный отек с ранней внутриальвеолярной организацией. Образцы в группе гриппа имели диффузное диффузное альвеолярное повреждение с массивным интерстициальным отеком и обширным отложением фибрина во всех случаях. Кроме того, три образца в группе гриппа имели очаговую организацию и резорбтивное воспаление (рис. S2). Эти изменения были отражены в значительно более высоком весе легких от пациентов с гриппом.

Иммуногистохимический анализ экспрессии ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE2), измеренный как среднее (± SD) относительное количество ACE2-положительных клеток на поле зрения, в неинфицированных контрольных легких показал недостаточную экспрессию ACE2 в альвеолярных эпителиальных клетках (0,053 ± 0,03) и капиллярные эндотелиальные клетки (0,066 ± 0,03). В легких пациентов с Covid-19 и легких пациентов с гриппом относительные количества ACE2-позитивных клеток на поле зрения составляли 0,25 ± 0,14 и 0,35 ± 0,15 соответственно для альвеолярных эпителиальных клеток и 0,49 ± 0,28 и 0,55 ± 0,11. соответственно для эндотелиальных клеток. Кроме того, ACE2-позитивные лимфоциты не были обнаружены в периваскулярной ткани или в альвеолах контрольных легких, но присутствовали в легких в группе Covid-19 и в группе гриппа (относительные значения 0,22 ± 0,18 и 0,15 ± 0,09 соответственно) ,

В легких пациентов с Covid-19 и пациентов с гриппом аналогичные средние (± SD) количества CD3-позитивных Т-клеток были обнаружены в радиусе 200 мкм от предкапиллярных и посткапиллярных стенок сосудов в 20 областях исследования на пациента (26,2 ± 13,1 для Covid-19 и 14,8 ± 10,8 для гриппа). При том же размере поля, использованном для исследования, CD4-позитивные Т-клетки были более многочисленными в легких от пациентов с Covid-19, чем в легких от пациентов с гриппом (13,6 ± 6,0 против 5,8 ± 2,5, P = 0,04), тогда как CD8- положительные Т-клетки были менее многочисленными (5,3 ± 4,3 против 11,6 ± 4,9, р = 0,008). Нейтрофилы (CD15-положительные) были значительно менее многочисленными, прилегающими к альвеолярной эпителиальной оболочке в группе Covid-19, чем в группе гриппа (0,4 ± 0,5 против 4,8 ± 5,2, P = 0,002).

Мультиплексный анализ экспрессии генов, связанных с воспалением, с исследованием 249 генов из nCounter Inflammation Panel (NanoString Technologies) выявил сходства и различия между образцами в группе Covid-19 и в группе гриппа. В общей сложности 79 генов, связанных с воспалением, были дифференциально отрегулированы только в образцах от пациентов с Covid-19, тогда как 2 гена были дифференциально отрегулированы только в образцах от пациентов с гриппом; общий ген экспрессии был обнаружен для 7 генов (рис. S1).

ТРОМБОЗ И МИКРОАНГИОПАТИЯ

Фигура 2.Микротромбы в межальвеолярной септе легкого у пациента, умершего от Covid-19.

Легочную сосудистую сеть легких в группе Covid-19 и группе гриппа анализировали с помощью гематоксилин-эозинового, трихромного и иммуногистохимического окрашивания (как описано в разделе «Методы» в дополнительном приложении ). Анализ прекапиллярных сосудов показал, что у четырех из семи легких пациентов с Covid-19 и у четырех из семи легких пациентов с гриппом тромбы постоянно присутствовали в легочных артериях диаметром от 1 мм до 2 мм без полного просвета. обструкция (рис. S3 и S5). Фибриновые тромбы альвеолярных капилляров можно было увидеть во всех легких обеих групп пациентов ( рис. 2). Альвеолярные капиллярные микротромбы были в 9 раз чаще у пациентов с Covid-19, чем у пациентов с гриппом (среднее [± SD] число отдельных тромбов на квадратный сантиметр площади просвета сосудов, 159 ± 73 и 16 ± 16 соответственно; P = 0,002 ). Внутрисосудистые тромбы в посткапиллярных венулах диаметром менее 1 мм наблюдались в меньших количествах в легких у пациентов с Covid-19, чем у пациентов с гриппом (12 ± 14 против 35 ± 16, P = 0,02). Два легких в группе Covid-19 имели поражение всех сегментов сосудистой сети по сравнению с четырьмя легкими в группе гриппа; в трех легких в группе Covid-19 и в трех легких в группе гриппа были обнаружены комбинированные капиллярные и венозные тромбы без артериальных тромбов.

Гистологические данные были подтверждены с помощью трехмерного микроКТ микроорганизмов легких: на легких у пациентов с Covid-19 и у пациентов с гриппом были обнаружены почти полные окклюзии прекапиллярных и посткапиллярных сосудов.

РАЗВИТИЕ КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ

Рисунок 3 Микрососудистые изменения в легких у пациентов, умерших от Covid-19.

Мы исследовали микрососудистую архитектуру легких у пациентов с Covid-19, легких у пациентов с гриппом и неинфицированных контрольных легких с использованием сканирующей электронной микроскопии и микрососудистого литья коррозии. Легкие в группе Covid-19 имели искаженную васкуляризацию со структурно деформированными капиллярами ( Рисунок 3 ). Удлиненные капилляры в легких у пациентов с Covid-19 показали внезапные изменения в калибре и наличие инвагинальных столбов внутри капилляров ( рис. 3C ). Трансмиссионная электронная микроскопия эндотелия Covid-19 показала ультраструктурное повреждение эндотелия, а также наличие внутриклеточного SARS-CoV-2 ( рисунок 3D ). Вирус также может быть идентифицирован во внеклеточном пространстве.